Clofazimina 66

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Clofazimina modula la expresión de proteínas en el metabolismo de los lípidos Mycobacterium leprae - macrófagos infectados Afiliaciones: Leprosy Research Center, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, Higashimurayama, Tokio, Japón, del Departamento de Lepra y Enfermedades Infecciosas, Hospital de Enfermedades de la piel Shanghai, Shanghai, China Afiliación: Centro de Investigación de la Lepra, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, Higashimurayama, Tokio, Japón Afiliación: Centro de Investigación de la Lepra, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, Higashimurayama, Tokio, Japón Afiliación: Centro de Investigación de la Lepra, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, Higashimurayama, Tokio, Japón Afiliación: Centro de Investigación de la Lepra, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, Higashimurayama, Tokio, Japón Afiliación: Centro de Investigación de la Lepra, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, Higashimurayama, Tokio, Japón Afiliación: Centro de Investigación de la Lepra, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, Higashimurayama, Tokio, Japón Afiliación: Centro de Investigación de la Lepra, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, Higashimurayama, Tokio, Japón Afiliación: Centro de Investigación de la Lepra, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, Higashimurayama, Tokio, Japón Clofazimina modula la expresión de proteínas en el metabolismo de los lípidos Mycobacterium leprae - macrófagos infectados Yang Degang, Takeshi Akama, Takeshi Hara, Kazunari Tanigawa, Yuko Ishido, Masaichi Gidoh, Masahiko Makino, Norihisa Ishii, Koichi Suzuki Abstracto Mycobacterium leprae (M. leprae) vive y se replica dentro de los macrófagos en una espumosa, fagosoma cargados de lípidos. Los lípidos proporcionan nutrición esencial para las micobacterias, y la infección por M. leprae modula la expresión de las proteínas del huésped importantes relacionados con el metabolismo de los lípidos. Por lo tanto, la infección por M. leprae aumenta la expresión de la proteína adipophilin / relacionados con la diferenciación adiposo (ADRP) y disminuye la hormona sensible a la lipasa (HSL), facilitando la acumulación y mantenimiento de ambientes ricos en lípidos adecuados para la supervivencia intracelular de M. leprae. HSL niveles no son detectables en las muestras de frotis de la piel tomadas de pacientes de lepra, pero vuelven a aparecer poco después de la poliquimioterapia (PQT). Este estudio examinó el efecto de los componentes MDT sobre el metabolismo lipídico de huéspedes in vitro. y el resultado de la rifampicina, dapsona y clofazimina en el tratamiento ADRP y expresión HSL en las células THP-1. Clofazimina atenuó el ARNm y los niveles de proteína de ADRP en M. leprae células con infección, mientras que los de HSL se incrementaron. Rifampicina y dapsona no mostraron ningún efecto significativo en los niveles de expresión de ADRP y HSL. Un aumento transitorio de interferón (IFN) - β y mRNA de IFN-γ se observó también en células infectadas con M. leprae y se trató con clofazimina. las gotas de lípidos acumulados por M. leprae: infección disminuyeron significativamente 48 horas después del tratamiento clofazimina. Estos efectos no fueron evidentes en las células sin infección por M. leprae. En muestras clínicas, la expresión de ADRP se redujo y la expresión HSL se aumentó después del tratamiento. Estos resultados sugieren que la clofazimina modula el metabolismo de lípidos en M. leprae macrófagos infectados por la modulación de la expresión de ADRP y HSL. También induce la producción de IFN en las células infectadas con M. leprae. La disminución resultante de la acumulación de lípidos, aumento de la lipólisis, y la activación de la inmunidad innata pueden ser algunas de las acciones clave de la clofazimina. Resumen autor La lepra, causada por el Mycobacterium leprae (M. leprae). es una enfermedad infecciosa antigua que sigue siendo la principal causa infecciosa de la discapacidad. Después de la infección, M. leprae vive dentro de los macrófagos del huésped que contienen una gran cantidad de lípidos, que se piensa que es un microambiente esencial para M. leprae sobrevivir en células huésped. infección por M. leprae aumenta la acumulación de lípidos en los macrófagos y disminuye la degradación metabólica de los lípidos (catabolismo). Además, el tratamiento de la lepra con la terapia de múltiples fármacos (MDT) invierte el efecto de la infección en la modulación del metabolismo de lípidos. El objetivo, por tanto, el uso de células de macrófagos humanos cultivados para determinar cuál de los tres fármacos (MDT clofazimina, dapsona, rifampicina) o es responsable de este efecto. Se encontró que sólo afecta a la clofazimina la acumulación de lípidos y el catabolismo en las células de M. leprae infectado con in vitro. Las cantidades de lípidos acumulados en las células disminuyeron cuando clofazimina se añadió al medio de cultivo celular. Clofazimina también activó la respuesta inmune en las células infectadas con M. leprae. Estos resultados sugieren que la eficacia de la clofazimina contra la lepra se debe a la modulación del metabolismo de los lípidos y la activación de las reacciones inmunes en M. leprae infectados con células huésped. Cita: Degang Y, Akama T, T Hara, Tanigawa K, Ishido Y, Gidoh M, et al. (2012) clofazimina modula la expresión de proteínas en el metabolismo de los lípidos Mycobacterium leprae - macrófagos infectados. PLoS NEGL Trop Dis 6 (12): e1936. doi: 10.1371 / journal. pntd.0001936 Editor: José M. Vinetz, Universidad de California, Escuela de Medicina San Diego, Estados Unidos de América Recibido: August 1, 2012; Aceptado: 20 Octubre 2012; Publicado: 6 de diciembre 2012 Copyright: © 2012 Degang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan. Financiación: Este trabajo fue apoyado por una subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica (C) de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Investigación de la Ciencia (# 23803000; jsps. go. jp/j-grantsinaid/index). La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en competencia. Introducción Lepra es una enfermedad infecciosa crónica causada por Mycobacterium leprae (M. leprae), que es un patógeno intracelular típico que parasita macrófagos tisulares (histiocitos) y células de Schwann de los nervios periféricos de la dermis. A pesar de su prevalencia ha disminuido en las últimas décadas debido a la introducción de la terapia con múltiples fármacos (MDT) por la Organización Mundial de la Salud (OMS), la lepra sigue siendo un importante problema de salud pública en muchos países en vías de desarrollo: En 2010, 228,474 nuevos casos fueron registrada en todo el mundo [1]. Con base en su clínica, histológica y las manifestaciones inmunológicas, los enfermos de lepra se clasifican en cinco grupos que comprenden uno espectro continuo: tuberculoide (TT), borderline tuberculoide (BT), Borderline (BB), borderline lepromatosa (BL) y la lepromatosa (LL) [ 2]. LL se caracteriza por lesiones cutáneas generalizadas que contienen numerosos bacilos que viven en la espumosa o fagosoma llenos de lípidos ampliada dentro de los macrófagos. Las células de Schwann en los nervios LL también tienen la apariencia espumosa, cargados de lípidos que favorece la supervivencia y la persistencia de micobacterias. En las células de Schwann, M. leprae biogénesis infección inducida de gotitas de lípidos se correlaciona con el aumento de la prostaglandina E2 (PGE2) y la interleucina-10 (IL-10) de secreción, que es esencial para la patogénesis de la lepra [3]. [4]. A pesar de que los macrófagos cargados de lípidos se observan también en otras infecciones por micobacterias, incluida la tuberculosis [5]. [6]. la cantidad de lípido y el número de macrófagos infectados son más prominentes en los casos de LL [7]. [8]. La familia de la proteína PAT es el nombre de tres de sus miembros: perilipina, proteína relacionada con la diferenciación adipophilin / adiposo (ADRP), y la cola de interacción con la proteína de 47 kDa (TIP47). miembros de la familia PAT son responsables para el transporte de los lípidos y la formación de gotas de lípidos en una variedad de tejidos y líneas celulares cultivadas, incluyendo adipocitos [9] - [12]. ADRP aumenta selectivamente la captación de ácidos grasos de cadena larga y tiene un papel esencial en el transporte de ácidos grasos [13]. [14]. lipasa sensible a hormonas (HSL), como la primera enzima identificada en la inducción de la acción lipo-catabólica iniciada por las hormonas, es el efector de la lipasa predominante de la lipólisis de catecolaminas estimulada en los adipocitos [15]. Por lo tanto, ADRP y HSL tienen funciones opuestas, es decir, la acumulación de lípidos frente a su degradación. ADRP y HSL también juegan un papel importante en la acumulación de lípidos en M. leprae infectados macrófagos [8]. [dieciséis]. infección por M. leprae aumentó la expresión de ADRP ARNm y proteínas, lo que facilita la acumulación y el mantenimiento de un ambiente rico en lípidos adecuados para la supervivencia intracelular [8]. Por el contrario, la expresión HSL fue suprimida en macrófagos infectados con M. leprae [16]. Estos resultados sugieren que tanto ADRP y HSL influyen en el medio ambiente rico en lípidos que favorece M. leprae parasitación y la supervivencia en células huésped infectadas. En nuestro estudio anterior, la expresión HSL no era detectable en las muestras de la prueba cutánea de los pacientes LL y BL no tratados, pero reapareció poco después del tratamiento MDT [16]. Sin embargo, cómo el tratamiento modula la expresión HSL no está claro. En el presente estudio, determinamos el efecto de los componentes MDT sobre el metabolismo lipídico de acogida mediante la investigación de la influencia de la rifampicina, dapsona y clofazimina en la expresión de ADRP y HSL en las células THP-1. Materiales y métodos declaración de ética muestras humanas se utilizaron de acuerdo con las directrices aprobadas por el Comité Ético del Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas (Tokio, Japón). Todas las muestras fueron anónimos antes de su uso. drogas Clofazimina (Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO), rifampicina (Wako Pure Chemical Industries Ltd. Osaka, Japón) y dapsona (Wako Pure Chemical Industries Ltd.) se disolvieron en sulfóxido de dimetilo (DMSO) y se almacenaron a 4 ° C . La concentración final utilizada en el medio de cultivo fue 8,0 g / ml de rifampicina, 5,0 mg / ml dapsona o 2,0 mg / ml clofazimina. aislamiento de M. leprae y cultivo celular desnuda ratas hipertensas (SHR / NCrj-NUR), infectados con la cepa de M. leprae Thai53 [17]. [18] fueron amablemente proporcionados por el Dr. Y. Yogui del Centro de Investigación de la Lepra, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas. Japón. El protocolo fue aprobado por el Comité Experimental Animal, del Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, Tokio, Japón (Permiso Número: 206055). Los estudios en animales se llevaron a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Ley de Protección de Animales de Japón. M. leprae fue aislado como se describe anteriormente [19]. [20]. La línea celular premonocítica humana THP-1 se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA). Las células se cultivaron en placas de seis pocillos en medio RPMI suplementado con 10% de suero tratado con carbón vegetal bovino fetal (FBS), 2% de aminoácidos no esenciales, 100 UI / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina a 37 ° C en 5% de CO 2 [7]. [8]. Típicamente, se añadieron 3 x 10 7 bacilos a 3 x 10 6 células THP-1 (multiplicidad de infección: MOI = 10). preparación de ARN y la reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) El ARN total a partir de células cultivadas se prepara utilizando RNeasy Mini Kits (Qiagen Inc. Valencia, CA) como se describe anteriormente [7]. [8]. preparación de ARN total a partir de muestras de frotis de hendidura de la piel se llevó a cabo como se describe [8]. [dieciséis]. En pocas palabras, hojas de acero inoxidable (Feather Safety Razor Co. de Osaka, Japón) que se utilizan para obtener muestras de la prueba cutánea se aclararon en 1 ml de etanol al 70% estéril. El tubo se centrifugó a 20.000 xg durante 1 min a 4 ° C. Después de retirar el sobrenadante, el ARN fue purificado con el mismo protocolo que se utilizó para las células cultivadas. El ARN se eluyó en 20 l de tampón de elución y se trató con 0,1 U / l de DNasa I (Takara Bio, Kyoto, Japón) a 37 ° C durante 60 min para degradar cualquier ADN genómico contaminante. Todas las muestras de ARN tenían una OD260 / 280 de 1,8-2,0 y un OD260 / 230 IFN-γ: 5'-GCAGAGCCAAATTGTCTCCTTTTAC-3 '(hacia delante) y 5'-ATGCTCTTCGACCTCGAAACAGC-3' (inverso) y actina: 5'-AGCCATGTACGTAGCCATCC - 3 '(hacia delante) y 5'-TGTGGTGGTGAAGCTGTAGC-3' (hacia atrás). Touchdown PCR se realizó usando una PCR Thermal Cycler DADOS (Takara Bio, Tokyo, Japan) [7]. [8]. Brevemente, la mezcla de PCR se desnaturalizó primero durante 5 min a 94 ° C, seguido de 20 ciclos de PCR de tres temperatura que consiste en una desnaturalización de 30 segundos a 94 ° C, un recocido de 30-sec que se inició a 65 ° C y la disminución 0,5 ° C cada ciclo a 55 ° C, y una extensión de 45 segundos a 72 ° C. Un 10 ciclos adicionales se realizaron para ADRP y β-actina, y 14 ciclos para HSL con una temperatura de hibridación fijo de 55 ° C. Los productos se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 2%. preparación de proteína y análisis de transferencia Western proteína celular se extrajo y se analizó como se describe anteriormente [16]. [21]. Brevemente, las células se lisaron en un tampón de lisis que contenía HEPES 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, 0,1% de NP40, 20% de glicerol, y cóctel inhibidor de proteasa (Complete Mini, Roche, Indianapolis, IN) durante 1 h. Después de la centrifugación, el sobrenadante se transfirió y 10 g de proteína se utilizó para el análisis. Las proteínas celulares se mezclaron con 4 x tampón de muestra LDS y 10 × agente reductor (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA) y se incubaron durante 10 min a 70 ° C antes de la electroforesis. Las proteínas se separaron en NuPAGE 4-12% Bis Tris geles y transfieren por medio de un dispositivo de transferencia de iBlot gel (Invitrogen). La membrana se lavó con PBST (solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 0,1% de Tween 20), bloqueado en tampón de bloqueo (PBST que contenía 5% de leche desnatada) durante una noche, y después se incubó con cualquiera de anticuerpo de conejo anti-ADRP (Santa Cruz Biotechnology Inc. Santa Cruz, CA; 1:2,000 dilución), anticuerpo de conejo anti-HSL (Cell Signaling Technology, Danvers, MA; 1:1,000 dilución) o de cabra anti-β-actina de anticuerpos (Santa Cruz; dilución 1:2,000). Después de lavar con PBST, la membrana se incubó durante 1 h con el anticuerpo anti-conejo de burro biotinilado para ADRP y HSL (GE Healthcare, Fairfield, CT; 1:2,000 dilución) o anticuerpo anti-cabra de burro biotinilado para β-actina (Millipore, Billerica, MA; dilución 1:10,000) seguido de estreptavidina-HRP (GE Healthcare; 1:10,000 dilución) durante 1 h. La señal fue desarrollado utilizando ECL Plus reactivo (GE Healthcare). tinción de lípidos células THP-1 se cultivaron en cubreobjetos de vidrio en placas de 24 pocillos durante 24 h, antes de que el medio de cultivo se cambió por medio RPMI 1640 que contiene M. leprae y la clofazimina. Control y células THP-1 tratados con fármaco se fijaron en formalina al 10% durante 10 min. Posteriormente fueron lavadas con PBS de Dulbecco (DPBS) y equilibrada con 60% de isopropanol durante 1 min antes de la tinción con aceite rojo-O (Muto Pure Chemicals, Tokio, Japón) durante 10 min. Las células se contratiñeron con hematoxilina durante 5 min seguido de la deshidratación de etanol y sellado cubreobjetos. La inmunohistoquímica , secciones de tejidos embebidos en parafina fijado en formol archivados se sometieron a tinción inmunohistoquímica como se describe [7]. Brevemente, las secciones desparafinadas se calentaron en NaOH 1 mM a 120 ° C durante 5 min para la recuperación de antígeno. Posteriormente fueron lavadas con PBST y se bloquearon en tampón de bloqueo (DAKO, Carpinteria, CA) durante 10 min, y luego se incubaron con anti-anticuerpo ADRP (Santa Cruz Biotechnology Inc .; 1:200 dilución) o anti-HSL anticuerpo (Cell Signaling Technology; 1:100 de dilución), durante 1 h a temperatura ambiente. Después de lavar los portaobjetos con PBST, se empleó el método de estreptavidina-biotina marcado con peroxidasa usando el kit LSAB2 (DAKO) y tetraclorhidrato de 3,3-diaminobencidina (DAB) para la tinción de ADRP. Tiramida método HRP amplificación de la señal (TSA) se utilizó para amplificar las señales de tinción HSL utilizando el Sistema de TSA Biotina (PerkinElmer, Inc. de Waltham, MA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las secciones fueron teñidas utilizando carbolfucsina para visualizar micobacterias acidorresistentes y contraste con hematoxilina. Otros Todos los experimentos fueron repetidos al menos tres veces. Dado que las repeticiones producen esencialmente los mismos resultados, los resultados representativos de estos experimentos independientes se muestran en las figuras. resultados Clofazimina disminuye ADRP y aumenta los niveles de ARNm de HSL en los macrófagos infectados con M. leprae El efecto de los fármacos sobre el metabolismo lipídico MDT en M. leprae infectados con macrófagos se examinó mediante la infección de células humanas premonocítica THP-1 con M. leprae (MOI = 10) en presencia de 8,0 g / ml de rifampicina, 5,0 mg / ml o dapsona 2,0 g clofazimina / ml durante 24 h. El ARN total se aisló y se realizó el análisis RT-PCR para evaluar los posibles cambios en ADRP y los niveles de ARNm de HSL. En nuestros estudios anteriores, la infección por M. leprae se ha demostrado que aumenta la ADRP y disminuir la expresión HSL, que a su vez aumentar la acumulación de lípidos que se cree que contribuyen a mantener un ambiente fagosoma que permite M. leprae a parasitar los macrófagos del tejido [8] . [dieciséis]. Sin embargo, cuando M. leprae infectados THP-1 células fueron tratadas con la clofazimina, los niveles de expresión ADRP disminuyeron y expresión HSL aumentaron (Fig. 1). Rifampicina y dapsona no mostraron efectos significativos en la expresión de ARNm de ADRP, mientras que disminuyó la expresión HSL aumentando el efecto de la infección por M. leprae. Figura 7. La inmunotinción de proteínas ADRP y HSL en muestras de biopsia de la piel antes y después del tratamiento. Secciones de las muestras de biopsia de piel tomadas de un paciente antes (A y C) y después (B y D) de tratamiento se sometieron a inmunotinción de ADRP (A y B) y HSL (C y D), seguido de tinción ácido-rápida para M . leprae y tinción de contraste con hematoxilina. Las flechas indican la membrana fagosoma que contiene M. leprae. Los resultados representativos de tres experimentos independientes se muestran. Bares = 20 micras. Discusión En estudios anteriores, hemos demostrado que la infección por M. leprae aumenta la expresión de ADRP y disminuye la expresión HSL en los macrófagos de acogida [8]. [dieciséis]. Los resultados del presente estudio demuestran que la clofazimina, uno de los tres fármacos principales que se utilizan para tratar la lepra, contrarresta el efecto de M. leprae para reducir ADRP y aumentar la expresión de ambos HSL mRNA y los niveles de proteína. Estos resultados son consistentes con nuestras observaciones en muestras clínicas obtenidas de pacientes de lepra, en la que los niveles de HSL no eran detectables en muestras de frotis de la piel antes del tratamiento, pero reapareció poco después de MDT [8]. [dieciséis]. Los otros dos fármacos MDT, dapsona y rifampicina, no revelaron ningún efecto sobre la expresión de cualquiera de ADRP o HSL. Micobacterias sobreviven al evadir el sistema inmune del huésped y el acceso a las vías metabólicas de acogida para obtener nutrientes para el crecimiento. M. leprae ha sufrido una evolución reductiva y pseudogenes ahora ocupan la mitad de su genoma [25] - [27]. por tanto, M. leprae se piensa que es la micobacteria más dependen de las vías metabólicas de acogida, incluyendo lípidos derivados del huésped. Como se informó anteriormente, la PGN puede activar TLR2 para aumentar la expresión de la HSL [16] y reprimir la expresión de ADRP y perilipina [7]. [8]. [21]. Estos efectos mediados por la vía de señalización iniciadas por los TLR se inducir la degradación de los lípidos, lo que hace que sea difícil para M. leprae para sobrevivir dentro de las células huésped. infección por M. leprae no sólo suprime la expresión HSL, sino también invalida todos los efectos de la PGN en ADRP y perilipina, asegurando así un entorno fagosoma que sea favorable para la supervivencia de micobacterias [16]. En el presente estudio clofazimina incremento en la expresión HSL y la disminución de la expresión de ADRP sólo en las células infectadas con M. leprae. Las cantidades de lípidos acumulados en las células disminuyeron cuando clofazimina se añadió al medio de cultivo celular. La disminución del medio ambiente rico en lípidos contra la supervivencia de M. leprae puede ser una de las acciones clave de la clofazimina. Clofazimina fue la primera riminophenazine clínicamente desarrollado para el tratamiento de la tuberculosis [28]. Su uso se ha extendido a muchas infecciones bacterianas gram-positivas, así como enfermedades micobacterianas [28] - [30]. El medicamento es ahora ampliamente utilizado para el tratamiento de la lepra, pero su mecanismo aún no está claro [31] - [33]. La droga es muy lipofílico y también está activo en la desestabilización de la membrana y la posible promoción de procesamiento de antígenos. actividad de la fosfolipasa A2 estimulada y la posterior acumulación de ácido araquidónico y lisofosfolípidos se confirmaron en la desestabilización de la membrana clofazimina inducida por [29]. [34]. El aumento de complejo principal de histocompatibilidad (MHC) clase II expresión en monocitos de sangre periférica [35]. hasta reguladas actividad de la enzima lisosomal de macrófagos cultivados [36] y la disminución de la actividad de células T supresoras en ratones micobacterias infectados [37] revelar el papel potencial de clofazimina en facilitar el reconocimiento inmunológico. Aunque los mecanismos moleculares subyacentes no están claros, clofazimina suprimida ADRP y HSL inducida, IFN-β y la expresión de IFN-γ sólo en las células infectadas con M. leprae. Los mismos efectos productos por PGN [8]. [dieciséis]. [21]. Por lo tanto, es posible que la clofazimina revive al menos algunas de las actividades de PGN, que normalmente está protegido por ácidos micólicos redundante en la pared celular de M. leprae. Dado el carácter lipófilo extrema de clofazimina y su actividad contra muchas bacterias Gram-positivas, clofazimina puede interactuar con los ácidos micólicos en la pared celular de M. leprae que facilita la exposición de los PGN, que a su vez activa las cascadas de señalización de TLR2 mediada, posteriormente disminuir ADRP y el aumento de HSL [8]. [dieciséis]. [21]. Además, puesto que la mayoría de las reacciones leprosas, a, hipersensibilidad de tipo retardado respuesta inmune mediada por células, se producen durante o después de MDT [38]. [39]. la perspectiva de que la clofazimina rescata actividades PGN blindados, promover la fusión lisosomal y procesamiento de antígenos, sería una explicación plausible para el gatillo de reacciones leprosas. Los resultados de los estudios actuales y anteriores pueden explicar los mecanismos subyacentes, al menos en parte, de parasitación exitosa de M. leprae y los efectos del tratamiento MDT observadas en los pacientes. En conclusión, hemos demostrado que la clofazimina devasta el medio ambiente rico en lípidos en M. leprae infectado con macrófagos huésped mediante la modulación de la expresión de ADRP y HSL y activa la respuesta inmune innata de las células infectadas, tanto de lo que sería importante en la lucha contra la infección micobacteriana . información de soporte Calidad de las muestras de ARN purificado a partir de células THP-1 infectadas con M. leprae. Las muestras de ARN se purificaron a partir de células THP-1 infectadas con M. leprae como se describe en los Materiales y Métodos. Diez muestras se analizaron usando un gel de agarosa desnaturalizado 1% (A) y cuatro fueron analizados con theAgilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) (B). La linealidad del análisis de RT-PCR. Las muestras de ARN se diluyeron en serie y se realizó RT-PCR análisis de ADRP, HSL y β-actina. bandas específicas en el gel de agarosa se cuantificaron utilizando el software ImageJ64. El efecto del tratamiento clofazimina simultánea y la infección por M. leprae en los niveles de ARNm en las células THP-1. células THP-1 se cultivaron en placas de seis pocillos con o sin 2,0 g clofazimina / ml en presencia de la infección por M. leprae (MOI = 10). Después de incubar durante el período de tiempo indicado, el ARN total se purificó y análisis PCR en tiempo real de ADRP (A), HSL (B) y β-actina se realizaron como se ha descrito previamente (referencia 8). Los mismos cebadores que se utilizaron para el análisis de RT-PCR se utilizaron con SYBER Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). Todas las muestras se amplificaron por triplicado a partir de la misma preparación de ARN. Cada resultado se expresa como la media ± SE. Se utilizó la prueba t de Student para el análisis estadístico. Un asterisco indica un valor de P0.001. Contribuciones de autor Concebido y diseñado los experimentos: YD KS. Realizado los experimentos: YD TA TH KT YI. Analizados los datos: YD KS. Contribuido reactivos / materiales / herramientas de análisis de MG: MM NI. Escribió el documento: YD KS. referencias 1. Organización Mundial de la Salud (2011) Resumen de la Lepra, 2011. Wkly Epidemiol Rec 86: 389-399. Ver artículo PubMed / Revista Google Académico 2. 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